NIPT fejlődése a világban és Szlovákiában:
| 1997 | szabadon keringő magzati DNS felfedezése |
| 1997 | magzat nemének nem invazív meghatározása az Y-kromoszóma szekvenciájával |
| 1998 | a szabad magzati DNSk kvantitatív analízise az anyai áramlatban |
| 1998 | a magzati RhD státusz nem invazív maghatározása |
| 1999 | szabad magzati DNS bizonyított gyors lebomlása a szülést követően, |
| 2000 | monogénes öröklődő betegségek nem invazív DNS tesztje (achondroplasia) |
| 2008 | kísérleti tanulmányok a magzati aneuploid meghatározására, |
| 2009 | első alkalmazás és a koncepció megerősítése, hogy az új generáció szekvenálása (NGS) a magzatnál engedélyezi a 21-es triszómiá megállapítását |
| 2010 | alaposan meghatározott töredezettségi eltérések az anyai és a magzati DNS-ben, |
| 2010 | részletes magzati térkép meghatározása nem invazív módszerrel, |
| 2011 | NIPT tesztek kereskedelmi elérhetősége, |
| 2012 | a teljes magzati genomikus szekvenálás nem invazív meghatározása, |
| 2015 | az első magzati DNS tesztelés bemutatása Szlovákiában, melyet nem invazív módon, az anya véréből végeznek, és ennek a klinikai praxisú felhasználása - TRISOMY teszt |
A teszt alapja
A vizsgálat kihasználja a perifériás anyai vérből kiválasztott magzati DNS teljes genomú szekvenálós analízisét. Az így megkapott adatok, melyek alacsony lefedettségűek, egy saját számítógépes algoritmus segítségével vannak kiértékelve és hitelesítve vannak a Bianchi és kol. (2012) által publikált eljárás alapján. *
* Bianchi DW a kol. Genome-wide fetal aneuploidy detection by maternal plasma DNA sequencing. Obstet Gynecol. 2012 May; 119 (5):890 – 901.
Klinikai jelentőség
A TRISOMY teszt célja a gyakori magzati triszómiák kiszűrése nagy szenzitivitás és specificitás mellett már a korai terhesség időszakában és így minimálisra csökkenteni az amniocentézisek szükségletét,* amely egy bizonyos vetélési kockázattal jár.
A megfigyelt triszómiák kiszűrésének magas szenzitivitása és specificitása ellenére a TRISOMY teszt egy szűrővizsgálat, nem pedig diagnosztikai módszer.
Gyakorlatban ez annyit jelent, hogy a TRISOMY teszt összes pozitív eredményét meg kell erősíteni egy invazív magzati genetikai mintavétellel (magzatvíz vagy chorionbolyhok mintavétele) és az ezt követő genetikai vizsgálatával (lásd hivatkozások).
A TRISOMY teszt negatív eredménye 99 % feletti prediktív értékkel jelenti vizsgálat kromoszóma eltérések alacsony kockázatát. A negatív eredményt általában nem szükséges invazív mintavétellel járó eljárással megerősíteni, ha gyanújelek nem állnak fenn (lásd hivatkozások).
A TRISOMY teszt Alap negatív eredménye 99 % feletti prediktív értékkel jelenti a 21-es, 18-as és 13-as triszómiák alacsony kockázatát.
A TRISOMY teszt XY negatív eredménye 99 % feletti prediktív értékkel jelenti továbbá a négy leggyakoribb ivari kromoszóma aneuploidia kockázatát.
A TRISOMY teszt COMPLETE negatív eredménye pedig a fentiek mellett több mint 100 mikrodeléciós és mikroduplikációs szindróma alacsony kockázatát is jelenti.
A TRISOMY teszt az Európai Humángenetikai Társaság álláspontja alapján lett összeállítva a kromoszóma aneuploidák nem invazív szűrővizsgálatáról, mely szerint csak a 21-es, 18-as és a 13-as kromoszómák triszómiáinak monitorozása szükséges . (Dondorp et al. 2015).*
* Bianchi DW a kol. Genome-wide fetal aneuploidy detection by maternal plasma DNA sequencing. Obstet Gynecol. 2012 May; 119 (5):890 – 901.
Javasló orvos
A vizsgálatot a nőgyógyászatra és szülészetre szakosodott orvos vagy klinikai genetikus javasolja.
Szenzitivitás és specificitás
Az NIPT tesztek általánosan ismertek a magas szenzitivitásukról és specificitásukról. A magzati DNS vizsgálat, melyeket a különböző laboratóriumok kínálnak, bizonyos műszaki részletekben térnek el egymástól. És ezzel összefüggnek az NIPT tesztekben elért kulcsfontosságú paraméterek értékei is. Legfőképpen:
- a kiszűrt magzati triszómiák százaléka – DetectionRate (DR),
- tévesen pozitív eredmények százaléka – False PositiveRate (FPR).
Az NIPT tesztek szenzitivitása a 21-es és a 18-as triszómiára, a konkrét laboratórium és a teszt típusától függően 94,4 – 100% között mozog 0-2,05 % közötti tévesen pozitív eredmény mellett.
A tesztek szenzitivitása a 13-as triszómiára alacsonyabb (79-92 %). Az NIPT sikertelenségének hátterében előfordulhatnak technikai hibák is, de az is, hogy a 13-as triszómiával szövődött terhességek a népesség körében nagyon ritkák. A téves pozitív esetek aránya a becslések szerint 1-2 % .
NIPT – kromoszóma-aneuploidia kimutatása – megbízhatóság
| Trial | Down syndrome | |
| DR (n (%)) | FPR (n (%) | |
| Chiu et al., 2011 | 86/86 (100) | 3/146 (2,1) |
| Ehrich et al., 2011 | 39/39 (100) | 1/410 (0,24) |
| Palomaki et al., 2011 | 209/212 (98,6) | 3/1471 (0,20) |
| Bianchi et al., 2012 | 89/90 (98,9) | 0/410 (0,00) |
| Sparks et al., 2012 | 36/36 (100) | 1/123 (0,81) |
| Ashoor et al., 2012 | 50/50 (100) | 0/297 (0,00) |
| Norton et al., 2012 | 81/81 (100) | 1/2888 (0,03) |
| Total | 590/594 (99,3) | 9/5745 (0,16) |
TRISOMY teszt – szenzitivitás és specificitás
| n = 203 | Szenzitivitás | 95 % CI | Specificitás | 95 % CI | nP |
|---|---|---|---|---|---|
| T21 | > 99 % | 90,97-100 % | > 99 % | 97,78-100 % | 39 |
| T18 | > 99 % | * | > 99 % | * | 5 |
| T13 | > 99 % | * | > 99 % | * | 2 |
n – a validációs vizsgálatban részt vevő minták száma összesen
nP – pozitív minták száma
CI – Confidence Interval konfidencia intervallum
* 95 % CI alacsony számú minták miatt a kiértékelés nem történt meg
Eredmény nélküli minták száma az NIPT tesztnél: < 5 %.
Eredmény nélküli minták száma a TRISOMY tesztnél: < 1 %.
A TRISOMY teszt szenzitivitása és specificitása teljes mértékben összemérhető a többi NIPT tesztek eredményeivel. Az analízis eredménye a validációs tanulmányon alapul és alátámasztja az ismert kariotípusú ellenőrzött minták analízisét is.
Az összes tanulmányba besorolt 21, 18 és 13 triszómiás minta sikeresen detektálva lett a TRISOMY teszt alkalmazásával.
Egyedi módszer a vérminta előállítására
Speciális alkotóeleme a laboratóriumi folyamatnak a vizsgálat során a TRISOMY teszt alkalmazásakor egy egyedi eljárás, amely biztosítja a magzati DNS magasabb arányát a kiinduló DNS állományhoz képest. Ez a magzati DNS és az anyai DNS fizikális különbségeiknek köszönhető. Az eljárásnak köszönhetően a TRISOMY teszt mintáiban a magzati DNS aránya átlagosan 16% (az átlagos magzati DNS arány a nyilvános források alapján 10 – 13 % között mozog). Még fontosabb, hogy ezzel a speciális eljárással feldolgozott minták egyikénél sem volt a magzati DNS aránya 7,5% alatti. . Ezáltal jelentősen lecsökken annak a kockázata, hogy a teszt a vizsgált mintában lévő magzati DNS alacsony aránya miatt téves/sikertelen legyen.
Az előkészületi eljárások, analízisek és az egészséges magzattal terhes nőktől származó minták kiértékelésének meghatározása alapján és a 21-es kromoszóma triszómiával érintett terhességek alapján, melyet a validációs tanulmányunkban használtunk, statisztikailag lehetséges meghatározni a tévesen pozitív és tévesen negatív eredményeket, melyek az anyai vérben található magzati DNS arányán alapulnak. Hozzáférhető adatok alapján ismert, hogy a magzati DNS arány a várandós nő vérében individuális és az alacsony magzati frakcióval jellemezhető minta csak a terhes nők kevesebb,mint 5%-ánál volt megfigyelhető (amagzati DNS aránya átlagosan 14,5% körül mozog). **
Általunk elkészített validációs tanulmány eredményei alapján, amelynél 164 egészséges magzattal terhes nő mintája volt analizálva és 39 mintánál jelen volt a 21-kromoszóma triszómiával érintett magzat, következtethető, hogy az átlagos magzati DNS aránya a terhes nőktől származó mintákban, melyeknek magzata a 21-es kromoszóma triszómiával volt érintett, elérte a 16% (kék görbe a grafikonban). Annak az esélye, hogy az analízis eredménye nem lesz informatív az ilyen arányú anyai vérben fellelhető magzati DNS mellett ~ 1:3 x 1013 és annak esélye, hogy az elért eredmény tévesen negatív lesz (tehát téves) alacsonyabb lesz mint 1:9×1018.
A mi tanulmányukban megfigyelt legalacsonyabb magzati DNS arányú mintánál, ami eléri a 7,5% (piros görbe) a nem informatív eredmény előfordulási valószínűsége ~ 1 : 15 és a tévesen negatív eredmények előfordulási valószínűsége alacsonyabb mint 1:740.
Az egészséges magzattal terhes nők mintáinak analízise arra utal, , hogy a nem informatív eredmény előfordulási valószínűsége ~ 1 : 161 és a tévesen pozitív (tehát a nem helyes) eredmények előfordulási valószínűsége alacsonyabb mint 1:30 000.
A tévesen negatív, illetve tévesen pozitív eredmények minimalizálása érdekében, a természetesen előforduló alacsony magzati frakcióval rendelkező terhességek következményében, az analízis eredményeinek kiértékelése során, egy nem informatív jellegű eredményt bemutató zóna van felhasználva. Ezt szürke aláfestésű zóna mutatja be a grafikonon (2. grafikon). Abban az esetben, ha analízis után a minta ebben a sávban helyezkedik el, a minta analízisét meg kell ismételni. Ezzel kapcsolatosan indokolt a terhes nőtől két hetes intervallumban vérmintát venni.
** Hudecova I, Sahota D, Heung MM, Jin Y, Lee WS, Leung TY, Lo YM, Chiu RW.Maternal plasma fetal DNA fractions in pregnancies with low and high risks for fetal chromosomal aneuploidies.PLoS One. 2014 Feb 28;9(2):e88484. doi: 10.1371/journal.pone.0088484
Adatok kiértékelése saját algoritmussal
Az egyes NIPT tesztek adatait, melyeket a szabad magzati DNS teljes genomjának szekvencia-analízise során az adatokat igényes matematikai modellek alapján értékeljük ki; az adatok az egyes laboratóriumok és alkalmazott eljárások függvényében változóak . Az kiértékelés célja az un. Z-érték meghatározása (4-es grafikon).
A TRISOMY teszt adatainak kiértékelésére készült saját, javított algoritmus lehetővé teszi,hogy a kiértékelt minták átlagos a Z-score értéke magasabb legyen, mint a versenytársaink által alkalmazott számítási módszerekkel elért érték.
Magasabb közép Z-érték a pozitív mintákban, melyek a javított algoritmus által kiértékelt TRISOMY tesztel érhetőek el, automatikusan tükröződnek a negatív és pozitív vizsgálati eredmények pontosabb eloszlásában, és ez engedélyezi az un. szürke sáv csökkentését (Area of Overlap), abban az esetben, ha nem lehet egyértelműen döntést hozni a vizsgálat során, mivel nem egyértelműen pozitív vagy negatív eredményről beszélünk.
Interferenciák.
Tekintettel arra, hogy a TRISOMY teszt nem diagnosztikai hanem szűrővizsgálat, így tévesen pozitív és tévesen negatív eredmények előfordulhatnak. Az analízis pozitív eredményét az aktuálisan elérhető diagnosztikai módszerrel meg kell erősíteni, azaz a magzatvíz genetikai vizsgálatával.
A negatív eredmény teljesen nem zárja ki a vizsgált triszómiák lehetőségét. Ennek okát képezheti a természetben előforduló méhlepény mozaicizmusa, eltűnő iker szindrómája, pontmutációk, gén inaktiválása vagy egyéb genetikai, illetve epigenetikai mechanizmus típusok, vagy idegen DNS jelenléte az anya vérében.
Az esetek nagyon alacsony százalékában nem lehetséges az NIPT tesztet egyértelmű eredménnyel lezárni. Az ilyen tesztet eredménytelennek minősítsük.***
A sikertelenség hátterében állhatnak technikai vagy biológiai okok. A teszt sikertelenségének legfőbb oka a nem megfelelő mintavétel vagy a minta nem megfelelő körülmények közötti,helytelen szállítása a laboratóriumba.
Leggyakoribb biológiai ok a teszt sikertelenségének a magzati DNS csökkent aránya a mintában az anyai DNS-el szemben. Abban az esetben, ha a magzati DNS arány a mintában alacsonyabb mint 4 % ez a teszt megbízhatóságát csökkenti, befolyásolja (5.grafikon). A tanulmányokban publikált analízis eredményei alapján az alacsony magzati DNS arányú frakciók mintájának várható előfordulása 1,5 – 6,1% között mozog.
A magzati DNS tartalmú (4% alatti) minták értékelésével elért adatok nem alkalmasak az értelmezésre.
*** M. M. Gil, M. S. Quezada, R. Revello, R. Akolekar, and K. H. Nicolaides, „Analysis of cell-free DNA in maternal blood in screening for fetal aneuploidies: updated meta-analysis,“ Ultrasound Obstet. Gynecol. 45 (3), 249-266 (2015)